CRISPR/Cas9 и генная инженерия эмбрионов человека

Сейчас все обсуждают новость о том, что в Великобритании разрешили ставить опыты по генетической модификации человеческих эмбрионов (пока без последующего выращивания из них детей). Про эту новость подробно написал образовательный ресурс N+1, поэтому повторять детали события я не буду, а лучше расскажу про саму науку. Про то, как изменились наши возможности редактирования ДНК за последние несколько лет.

Впервые редактирование ДНК эмбриона человека осуществили в прошлом году исследователи из Китая. Для редактирования ДНК использовалась элегантная технология, за которую непременно дадут Нобелевскую премию, – CRISPR/Cas9.

Эту биотехнологию, как это часто бывает, ученые позаимствовали у природы. В данном случае у некоторых бактерий, у которых CRISPR/Cas9 играет важную роль в распознании и уничтожении вирусов. У этих бактерий в ДНК есть что-то вроде пополняемой базы данных фрагментов вирусных последовательностей (очень похоже на то, как работают многие компьютерные антивирусные программы). Бактерии синтезируют многочисленные РНК копии сохраненных вирусных фрагментов, а белок Cas9 использует эти копии для того, чтобы находить настоящих вирусных захватчиков и разрезать их (Рисунок 1), как полиция определяет преступников, сверяясь с фотографиями или отпечатками пальцев.

Не составляет труда подсунуть белку Cas9 искусственно спроектированную путеводную РНК, такую, чтобы направить его на разрезание практически любой заданной последовательности ДНК, в том числе и человеческой. Или ДНК вирусов, пытающихся человека заразить. В случае с вирусами – создание разрезов в их ДНК является самоцелью, способом защиты от инфекции. В случае с редактирование ДНК человека или другого организма, точный разрез нужен для последующей точной вставки какого-нибудь полезного гена (Рисунок 3).

Сегодня CRISPR/Cas9 используют для редактирования ДНК разнообразных организмов и даже возникают идеи, что частично пересадив эту систему бактериального иммунитета человеку или другому организму, мы сможем добавить новый уровень защиты от патогенов. В 2015 году в журнале Genome Biology вышла статья, авторы которой перенесли этот механизм иммунитета в растение, родственное табаку, защитив его от некоторых вирусов. Тем временем, на изолированных человеческих клетках было показано, что данный подход, позволяет направленно вырезать встроенные в хромосомы ДНК-копии вируса иммунодефицита человека (ВИЧ).

Вполне вероятно, что именно с помощью CRISPR/Cas9 мы когда-нибудь окончательно победим ВИЧ, о чем подробней я рассказываю в книге «Сумма биотехнологии».

В упомянутой работе китайских ученых было отмечено, что часто редактирование ДНК с использованием CRISPR/Cas9 происходило в нежелательных местах, а значит, прежде чем мы сможем создавать генетически модифицированные эмбрионы человека, технологию нужно существенно доработать. Из этических соображений мы не можем допустить, чтобы рождались дети-инвалиды с мутациями, случайно внесенными технологией.

Именно поэтому так важно, что с момента, как китайские ученые начали свое исследование по генной инженерии эмбрионов, наука сильно шагнула вперед и точность редактирования ДНК с использованием CRISPR/Cas9 выросла на порядки.

Как я описывал ранее (в том числе и в книге), появилась статья про новую мутантную форму белка Cas9, в 25 раз более специфичную, чем та, что была исходна обнаружена у бактерий. Кроме того, было найден биохимический метод воздействия на клетки, увеличивающий эффективность редактирования генома с помощью Cas9 в 17 раз. Были обнаружены гены, временно выключая которые, удается повышать эффективность редактирования генома в 8 раз. Еще две группы ученых получили мутантный белок Cas9, который редактирует ДНК только после активации светом, что имеет свои интересные применения.

Но я еще не писал о том, что в этом году в журнале Nature вышла статья, авторы которой утверждают, что разработали вариант Cas9 под названием SpCas9-HF1, который уже совсем не делает ошибок или делает их так мало, что обнаружить их современными методами анализа ДНК затруднительно.

Ранее появились удивительные ухищрения, позволяющие увеличить точность редактирования ДНК с использованием CRISPR/Cas9. При одном из таких подходов ДНК-мишень узнавалась не одним белком Cas9 с направляющей РНК, а одновременно двумя умышленно «испорченными» Cas9 с разными направляющими РНК. Направляющая РНК распознает участок ДНК длиной примерно в 20 нуклеотидов (т.е. букв A, T, G,C), но для разреза не всегда требуется полное совпадение, поэтому в геноме человека, в котором имеется 3 миллиарда нуклеотидов, может случайно найтись несколько участков, похожих на предполагаемое место разреза (что приведет к ошибкам). Упомянутые «испорченные» белки Cas9 не разрезают две цепочки ДНК, как обычно, а только одну из двух, поэтому разрез легко исправляется клеткой и только если два таких белка одновременно узнают два соседних участка ДНК, разрез пройдется по двум цепям (Рисунок 4).

Совсем радикальный метод заключается в том, что белок Cas9 можно «испортить» еще больше, чтобы он вовсе не мог разрезать ДНК, но по-прежнему мог распознавать специфические участки, используя путеводную РНК. К таким испорченным версиям Cas9 с использованием генной инженерии приделываются половинки фермента, который умеет разрезать определенную последовательность ДНК. Теперь для разрезания ДНК необходимо еще больше условий: два белка Cas9 с разными путеводными РНК должны узнать два соседних участка, расположенных на таком фиксированном расстоянии, чтобы две половинки фермента образовали целый фермент, который еще должен узнать специфичное для него место потенциального разреза (Рисунок 5). Случайно такое произойти практически не может.

Скоро мы научимся редактировать ДНК абсолютно точно, с первой попытки и с высокой эффективностью и тогда станет возможным практическое применение генной инженерии для создания генетически модифицированных (дизайнерских) детей. С развитием наших знаний о генетике человека, в будущем можно будет устранять даже малые генетические дефекты, задавать желаемый цвет глаз или волос, улучшать физические и умственные способности людей.

В конце прошлого года в журнале Science была опубликована работа, авторы которой вылечили мышей, страдающих наследственной формой мышечной дистрофии с помощью CRISPR/Cas9. Это еще одно важное применение технологии – генная терапия, позволяющая лечить от генетических заболеваний даже взрослые организмы. Генная терапия имеет применение в лечении не только наследственных заболеваний, но и рака, ведь мы умеем создавать специальные генетически модифицированные клетки иммунной системы, выискивающие клетки некоторых злокачественных опухолей.

Наконец, еще одна группа исследователей получила с помощью Cas9 генетически модифицированные сперматозоиды (пока что крыс). Если нам удастся перенести данную технологию на людей, то мы сможем создавать генетически модифицированное потомство, не вмешиваясь в развитие эмбрионов, что снимет часть этических вопросов.

Все вышесказанное – важнейшие этапы на пути к «автоэволюции», о которой писал писатель, футуролог и фантаст Станислав Лем. Автоэволюция – это когда жестокий, но естественный отбор, двигающий эволюцию путем устранения неприспособленных особей, постепенно заменяется на «разумный замысел», при котором организмы улучшаются без лишних жертв, а еще лучше: при жизни. Мы живем в мире стремительного прогресса, но самое удивительное, что скоро меняться начнем и мы. Пора готовиться!

P.S. Недавно ученые сняли как ДНК разрезается белком Cas9 на видео.

Прикладываю список научных статей, в которых изложены упомянутые научные открытия: