Мышиные Hind Лимб длинных трубчатых костей Вскрытие и костного мозга Изоляция

Все для животных работа была одобрена Institutional уходу и использованию животных комитета в соответствии с рекомендациями, изложенными в Руководстве по уходу и использованию лабораторных животных Национальных институтов здравоохранения.

1. Hind Лимб длинных трубчатых костей Рассечение

1. Эвтаназии мыши в соответствии с ведомственным руководящим принципам.
2. Поместите мышь в положении лежа на спине и наклейте закрепив все четыре ноги через мышь подушечки лап ниже голеностопного сустава.
3. Спрей мышь с 70% этанола, тщательно обливание ног.
4. Сделайте небольшой надрез справа от средней линии в нижней части живота, чуть выше бедра.
5. Расширьте надрез вниз по ноге и мимо голеностопного сустава.
6. Оттяните кожу и разрезать четырехглавой мышцы, прикрепленной к проксимального конца бедренной кости, чтобы выставить переднюю сторону бедра и пин-код из ноги, поместив палец под углом 45 градусов от борта.
7. С Bladе ножниц против задней стороны бедра, отрежьте бицепсы от коленного сустава.
8. Оттяните кожу и мышцы подколенного сухожилия, прикрепленной к проксимального конца бедренной кости, чтобы выставить заднюю сторону бедра и пин-код из ноги, поместив палец под углом 45 градусов от борта.
9. С помощью щипцов, удерживая дистальный конец бедренной кости, чуть выше коленного сустава. Руководство лезвия ножниц по обе стороны от бедренной кости к тазобедренного сустава, стараясь не врезаться в самой бедренной кости.
10. После достижения головки бедренной кости, с указанием ножниц открытия слегка скрутите ножницы с верхним лезвием ножниц, движущихся непосредственно над головки бедренной кости вывихнуть бедренной кости, стараясь не замкнуть кости ниже головки бедренной кости.
11. Возьмитесь за верхнюю часть бедренной кости с пинцетом, разрезал мягкие ткани от головки бедренной кости, чтобы освободить его от вертлужной.
12. Вытащите всю кость ноги, в том числебедренной кости, колена и голени, вверх и в сторону от тела, тщательно срезая соединительной ткани и мышц, соединяющий ногу к коже.
13. Перенапрягать голеностопный сустав и снова использовать ножницы в вращательным движением вывихнуть берцовой кости.
14. Схватив дистального конца большеберцовой кости, следя за тем, чтобы не перерезать сухожилия, потяните голень вверх и в сторону от тела и пин-плате.
15. Вырезать все оставшиеся соединительной ткани имеется длинный кость мыши в колене.
16. Удалите любые дополнительные мышцы или соединительной ткани, прикрепленный к бедренной и большеберцовой кости.
17. Для любых приложений, требующих кости , чтобы оставаться неповрежденными (гистология, Гистоморфометрия, биомеханические тестирование и т.д.) . , Действуйте со стандартными протоколами в доме (как в 4-7). Чтобы изолировать костный мозг, переходите к разделу 2.

2. Длинные косточки Подготовка к изоляции костного мозга

1. Используя пинцет, возьмитесь бедренной кости с надколенника лицом прочьй проксимальный конец (головка бедренной кости) вниз.
2. Перенапрягать коленного сустава и использовать ножницы в вращательным движением вывихнуть берцовой и бедренной костями.
3. Вырезать любой соединительной ткани, проведение бедренной и большеберцовой костей вместе.
4. Используя пинцет, возьмитесь бедренной кости с передней стороны, обращенной в сторону и проксимального конца бедренной кости (конец головки) вниз.
5. Руководство ножницы вверх бедренной кости к мыщелков.
6. Осторожно повернуть ножницы назад и вперед, чтобы удалить мыщелков, коленной чашечки, и эпифиз выставить метафиза.
7. Удалите любые дополнительные мышцы или соединительной ткани, прикрепленный к бедренной кости с помощью щипцов, ножниц и Kimwipes.
8. Используя пинцет, возьмитесь за голень с передней стороны, обращенной в сторону и дальний конец (конец голеностопа) вниз.
9. Если большеберцовой эпифиза цела, руководство ножницами вверх большой берцовой кости вала до мыщелков.
10. Осторожно повернуть ножницы назад и вперед, чтобы удалить мыщелков и эпифиз, чтобы выставить metaphлиз.
11. Удалите любые дополнительные мышцы или соединительной ткани, прикрепленный к большеберцовой кости с помощью щипцов, ножниц и Kimwipes.

3. Выделение костного мозга

1. Принудительную 18 G иглу через нижнюю часть 0,5 мл трубки микроцентрифужных.
2. Поместите длинные кости (максимум 2 бедрами и голенями 2) в трубку, по колено конец вниз концом вниз и закройте крышку.
3. Гнездо 0,5 трубки микроцентрифужных мл в 1,5 мл трубки микроцентрифужных.
4. Центрифуга вложенными пробирки при ≥10,000 XG в микроцентрифуге в течение 15 сек.
5. Убедитесь в том, что костный мозг был растягивал из костей с помощью визуального осмотра. Кости должны выглядеть белым и не должно быть большой визуальный осадок в большую трубу.
6. Откажитесь от 0,5 мл микроцентрифужных трубку с костями.
7. Приостановка костный мозг в соответствующем растворе (например, PBS, культуральные среды, FACS буфер) и продолжить экспериментальный протокол (ДНК, РНК или выделения белка,Анализ FACS, или первичной культуры клеток).

Протокол, описанный здесь, оптимизирован для быстрой рассечения бедренной кости мыши и большеберцовой кости с минимальным повреждением костной ткани. Этот метод подходит для целого ряда последующих анализов, включая исследования биомеханики, гистоморфометрии (рис 1А - В) и гистологии (рис 1C) 4,7. Представитель histomophometric micoCT 3D реконструкция (Рисунок 1А - B) показывает , что как губчатой ​​кости и кортикального оболочки сохраняются , что позволяет точно оценить стандартизированных структурных параметров для гистоморфометрии кости, в том числе губчатой ​​количества, толщины и расстояния; объем костной ткани; и кортикальную толщину, среди прочих мер 8. Представитель гистологические секции показывает H & E окрашивали фиксированные формалином и декальцинированной берцовой (рис 1C). Изображение демонстрирует целостность обоих кальцифицированного Ьодин и клеточный костный мозг для гистологического анализа.

Процедура костного мозга изоляция сохраняет стерильность пространства костного мозга, имеет низкую обработку для снижения загрязнения, и не требует нарезку длинной кости, тем самым уменьшая потери урожая костного мозга. Этот костный мозг подходит для многих последующих применений, в том числе проточной цитометрии 5 и ПЦР - анализ. Кроме того, эта процедура может быть использована для выделения костного мозга для первичной культуры клеток клеток костного мозга, в том числе остеокластов и остеобластов (фиг.2А - B) -4,6.

Рисунок 1. Гистоморфологические и гистологические анализы мышей длинных трубчатых костей. Трехмерная microCT реконструкция большеберцовой кости мыши , показывая (A) наружный кортикальный оболочку и (B Чонг>) губчатая кость (масштаб бар = 0,5 мм). (C) Гистологическое H & E пятно в декальцинированной и секционного большеберцовой кости (4x). Изображения любезно предоставлены Кэтрин Weilbaecher, Вашингтон школы медицины университета, США. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.